Labor

Um einen Einblick in die "Geheimnisse" der Stammzellgewinnung und die nachfolgende Zellkultur zu geben wurde die Verarbeitung einer Knochenmarksprobe und verschiedenen andere Schritte der Laborarbeit photographisch dokumentiert.

Stammzellen aus Knochenmark

1. Vorbereitung der Knochenmarkprobe

Der Versand des Knochenmarks vom Tierarzt ins Sanvivax Labor erfolgt in normalen Spritzen. In der Regel besteht eine Probe aus ca. 40 - 80 ml Knochenmark, verteilt auf eine entsprechende Menge Spritzen. Diese Spritzen werden sorgfältig desinfiziert und in eine Steril-Werkbank ("clean bench") gebracht. Dort wird das Knochenmark, das etwas zähflüssiger ist als Blut, zuerst etwas verdünnt, da sich in einer zu zähen Probe später die verschiedenen Zelltypen nicht richtig trennen lassen. Diese Trennung erfolgt über eine sog. Dichtegradientenzentrifugation. Dazu wird das verdünnte Knochenmark über eine spezifisch schwerere Separationsflüssigkeit (farblos) geschichtet. Diese Grenzschicht zwischen leichter und schwerer Flüssigkeit ist der eigentliche Dichtegradient.

2. Dichtegradientenzentrifugation (Erste Zentrifugation)

Um die Separation zu beschleunigen wird die so vorbereitete Probe zentrifugiert. Dabei sinken alle Zellen in der Probe unter der Wirkung der Zentrifugalkraft zu Boden. Die roten Blukörperchen sind dabei dichter als die Separationsflüssigkeit und sinken durch die Grenzschicht bis zum Boden des Zentrifugenröhrchens. Die weissen Blutkörperchen sinken zwar ebenfalls im verdünnten Blut nach unten, schwimmen jedoch oben auf der Separationsflüssigkeit, da sie leichter sind als diese. Nach einer halben Stunde und einigen weiteren Minuten, in denen die Zentrifuge ganz langsam bremst, um die Grenzschicht nicht zu verwirbeln, wird das Ergebnis der Trennung sichtbar. Oben das gelbliche Blutserum, an der Grenzschicht die "Wolke" der weißen Blutkörperchen, von denen wiederum ein kleiner Teil, etwa 0,1% die gesuchten Stemmzellen sind, darunter die farblose Separationsflüssigkeit und unten die Masse der roten Blutkörperchen

3. Abheben der Zellen

Die weißen Blutkörperchen, die auf der Phasengrenze zwischen Serum und Separationsflüssigkeit schwimmen, werden abpippetiert. Dabei erwischt man immer etwas von der schweren Separationsflüssigkeit. Deswegen wird die Suspension der weißen Blutkörperchen nochmals mit "leichter" Flüssigkeit verdünnt, damit die Zellen sicher schwerer sind als die umgebende Flüssigkeit. Nun können die Zellen durch Zentrifugation am Boden des Zentrifugenröhrchens als "Pellet" gesammelt werden.

4. Dritte Zentrifugation

Die gelbliche Flüssigkeit über den Pellets, die Reste von Blutplasma und von der Separationsflüssigkeit enthält, wird entfernt, so das nur die schon recht sauberen Zellen zurückbleiben. Diese Pellets werden nun wiederum mit reiner Flüssigkeit aufgenommen und in ein einzelnes Röhrchen überführt. Die Zell-Suspension wird ein weiteres Mal zentrifugiert und anschließend wiederum die praktisch farblose Flüssigkeit über dem Pellet entfernt. Damit sind praktisch alle Verunreinigungen weggewaschen und die "weißen" Blutkörperchen - die rosarote Farbe des Pellets kommt von einigen verschleppten roten Blutkörperchen - werden nun mit Nährmedium versorgt und auf spezielle Zellkulturplatten überführt und im Brutschrank in eine optimale Umgebung für Wachstum und Vermehrung gebracht.

Stammzellen aus Fettgewebe:

Fettgewebe wird zuerst per Skalpell und anschließen enzymatisch in einzelne Zellen zerlegt. Diese Prozedur ist, aufwändig, langwierig und nicht sehr fotogen. Im Endeffekt bleibt auch hier ein winzig kleines Pellet zurück, das in der Regel durch einige unvermeidliche rote Blutkörperchen rosarot gefärbt ist. auch dieses Pellet wird mit Nährmedium versorgt und die Zellen anschließend auf den Zellkulturplatten im Brutschrank kultiviert.

Ablauf einer Zellkultur, hier am Beispiel von Stammzellen aus Fettgewebe:

Nach 24h haben sich in diesem Bildausschnitt zwei der Stammzellen auf der Zellkulturplatte festgesetzt. Die Form der Zellen ist zu diesem frühen Zeitpunkt noch kugelig. All die anderen, kleinen Zellen sind rote Blutkörperchen, die zu diesem Zeitpunkt noch nicht durch Waschen entfernt wurden.

Nach 48 h haben die Stammzellen bereits ihre charakteristische "Spindelform" angenommen, wobei sie nach wie vor gut unter den roten Blutkörperchen versteckt sind.

Nach dem Waschen ist die kleine Kolonie der Stammzellen besser erkennbar.

Derselbe Bildausschnitt nochmals 24h später (Tag 4 der Zellkultur), die Zellen vermehren sich rasch

Derselbe Bildausschnitt an Tag 5 der Zellkultur

Tag 9: Zwischenzeitlich wurden die entstandenen Kolonien geerntet und die Zellen auf neue Platten überführt. Diese Platten sind nun relativ gleichmässig mit den Zellen belegt.

Tag 11: Die Platten sind fast vollständig belegt

Tag 12: Fertig!Die Zellen auf den nun vollständig zugewachsenen Platten werden abgelöst und sind bereit zum Versand, bzw. für die Cryolagerung.